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免疫组织化学（IHC）已成为临床及转译研究、诊断病理学必不可少的工具。免疫组织化学染色的强度和组织分布在临床病理学中对诊断和治疗的机会有重要的影响。预后生物标记物，例如Ki67在乳腺癌中的表达(Yamamoto et al., 2013)，为病人可能的健康结果提供了相关信息。预测生物标记物则表明了患者从特定治疗中得到的可能的益处，例如Her2的过表达和扩增是对曲妥珠单抗的预测性响应(Hofmann et al., 2008)。但研究项目也取决于有复验性的结果。
许多组织处理参数已被发现可影响IHC-P染色结果：
4. 冷缺血会影响FFPE组织中磷酸化表位的稳定性(Bonnas et al., 2012)。
5. 固定剂会影响组织形态和IHC 染色结果(Nietner et al., 2012)。
6. 不充分的固定时长会导致抗原性下降(Werner et al., 2000)。
SYSY标准的组织准备实验方案包含一个在中性福尔马林缓冲液中固定24 hrs的步骤。然而，客户有可能会使用其它的固定方案。因此，我们分别使用三个不同时间点：13 hrs （假定固定时长不足)，24 hrs （标准固定时长）和48 hrs (假定固定时长过多)，评估了福尔马林固定时长对小鼠脾脏中免疫组织化学抗原检测的影响。我们分别检测了八种直接针对常见鼠类免疫细胞亚型的HistoSure抗体。
• T 细胞：CD3e HS-413 117, CD3e HS-413 003, CD4 HS-360 117, CD8a HS-361 003
• B-细胞：CD19 HS-439 003
• 巨噬细胞：F4/80 HS-397 017
• 树突状细胞：CD11c HS-375 003
• 白血球 (所有标记物)：CD45 HS-427 017
染色根据附带的HistoSure IHC-P参考方案进行。我们使用了4个评分系统（染色强度比分，SIS）： 0 （未染色），1 （轻染色），2 （中等染色）和3（重染色），对3-4个独立实验的染色强度进行了评估。
图1：小鼠脾脏切片在中性福尔马林缓冲液中分别固定13 hrs（浅蓝色），24 hrs（蓝色）或者48 hrs （深蓝色）后HistoSure 抗体染色强度评分。坡度和箭头颜色反映了在福尔马林中固定的时间点13 hrs和48 hrs之间染色强度的不同。白色= 没有不同；黄色=轻微不同；红色=非常不同。
图2：使用热图比较不同福尔马林固定时间点间染色强度评分（SIS）的平均值。（ΔSIS24-13：SIS平均值在24 hrs 和13 hrs的区别；ΔSIS48-24：SIS 平均值在48 hrs 和24 hrs的区别；ΔSIS48-13：SIS平均值在48 hrs 和13 hrs的区别）。白色= 没有不同；黄色=轻微不同；红色=非常不同。
通常，IHC-P染色在固定不足13 hrs时会更敏感 （图1和2）。染色强度平均值在13 hrs 和 24 hrs固定时间点之间有0.33的区别，而在 24 hrs 和48 hrs 固定时间点之间有0.25的区别。在我们的研究中，SIS48-13 （图3；最后一列）热图中红色或者深红色表明抗-CD45 染色（图1和3）和抗-CD8a 染色（图1）受到了不同福尔马林固定时长的极大影响。仅有 抗-CD19 染色未受福尔马林固定时长的影响（图4）。
图3：使用大鼠抗-CD45 HS-427 017抗体 ，对在中性福尔马林缓冲液中固定了13 hrs，24 hrs 或者48 hrs的鼠类脾脏进行免疫组化染色。随着福尔马林固定时长的增加，染色强度评分从1增加到了2.5。
图4：使用兔抗-CD19 HS-439 003抗体，对在中性福尔马林缓冲液中固定了13 hrs，24 hrs 或者48 hrs的鼠类脾脏进行免疫组化染色。在所有福尔马林固定的时间点，染色强度评分是相同的。
虽然大多数HistoSure抗体在小鼠脾脏固定 48 hrs时，显示更好的结果，但使用SYSY推荐的染色方案，抗-F4/80在小鼠脾脏固定24 hrs时显示最佳染色结果（图1和2）。
因此，充分的福尔马林固定对染色结果非常重要。不充分的固定将不仅仅造成免疫组织化学抗原性的丢失，也会导致较差的组织形态。此外，延长固定可能会对染色强度评分产生消极影响。因此，福尔马林固定时长的标准化对IHC-P实验的重现性很重要。SYSY推荐组织在中性福尔马林缓冲液中的固定时长为24 hrs。